来了！新冠肺炎假阴性四大原因

来源：赛柏蓝器械

国家卫建委：结果阴性也可能感染

2月21日，国家卫健委印发《新型冠状病毒肺炎防控方案（第五版）》，在实验室检测技术指南中明确指出，核酸检测结果阴性不能排除新冠病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素。

具体因素包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。

近日在广东省人民政府新闻办公室举行发布会上，国家卫健委高级别专家组组长、中国工程院院士钟南山也表示，用核酸检测确诊是正确的，但还要看取材，绝大多数采样是取鼻和咽，如果采样不准确，会造成很大的结果差异。

同时钟南山还表示，核酸检测的准确性并没有媒体说的那么低。之前有媒体报道称，核酸检测的准确率只有30%-50%左右，有的甚至说只有20%-30%，其实核酸检测应该是比较准确的。

核酸检测准确率不会这么低，但国内也确有患者检测4次都是阴性，第5次才是阳性的情况。

2月8日，浙江青田县新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控工作指挥部发布公告称，51岁男性患者章某某，2月1日起连续4次核酸检测均为阴性，2月7日第5次核酸检测呈阳性，确诊为新型冠状病毒感染的肺炎病例。

1月30日《人民日报》报道，天津一例新型冠状病毒患者在1月25日、1月28日共进行3次核酸检测，都为阴性，但是在1月30日的第四次检测中呈阳性。

检测四五次才能确诊，这些真的是因为新型冠状病毒太狡猾吗？

核酸检测是金标准，没有疑问

想知道为什么出现假阴性，就要知道核酸检测试剂盒如何检测新冠病毒。

根据国家卫健委临床检验中心介绍，新型冠状病毒与2003年的SARS冠状病毒一样，由RNA核酸和蛋白等组成。RNA核酸由四种不同碱基排列而成，不同病毒的核酸碱基排列方式，就像发报的密电码，各有不同。

因此可以通过采集人的特定部位细胞样本，检测其中是否含有病毒RNA核酸，确认机体是否受到感染。

核酸检测就像分析密电码，新型冠状病毒也有其特异的密电码，但与其它冠状病毒也有相似性，根据2月19日国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》，目前研究显示，新型冠状病毒与蝙蝠SARS样冠状病毒同源性达85%以上。

新型冠状病毒的RNA核酸约有3万个碱基，不同区域和其它冠状病毒的相似性有所不同，有些区域相似度高达90%以上，因此核酸检测试剂选择相似度低的区域进行，这样就可以特异地识别新型冠状病毒。

就像同一地区身份证号有几位数字相同，那么就通过其他区域的数字对个人进行区分。

进行区域识别后，如果核酸检测结果为阳性，即证明新冠病毒特有的RNA核酸存在，即感染新冠病毒。通常我们说病毒核酸检测是确诊感染的“金标准”，这个“金标准”就是指“阳性”结果。

近期有部分一线医生和业内人士建议将CT也作为诊断标准，但严格来讲，CT的准确性比不上核酸检验，更无法替代核酸检测。

近日中华医学会检验医学分会主任委员王成彬发布文章表示，核酸检测从方法学层面考虑其作为实验室诊断金标准没有任何疑问。

CT作为临床影像学筛查指标具有重要价值，但无论从早期诊断、鉴别诊断、排除诊断还是*终确诊等方面都还具有一定的局限性，更无法替代病原学诊断。

假阴性的四方面原因

对核酸检验假阴性，不少声音将原因指向核酸检测试剂盒，但实际上核酸检测是一个流程，任何一个环节出现问题，都有可能导致假阴性。

根据国家卫健委临床检验中心信息，在被感染者中检出核酸，需同时满足以下四个条件：

（1）被感染者的细胞中有一定量的病毒；

（2）采集标本时，必须采集到含有病毒的细胞；

（3）可靠的体外诊断试剂；

（4） 规范的临床核酸检测实验室（合理的分区、有能力的检测人员和严格的质量管理体系）。

以上4个条件就是可能导致假阴性的4方面因素。

患者：可能病毒含量太少

核算检测试剂对感染者体内的病毒存在量有一定要求，如果病毒含量太少，现有的方法或许检测不到。

据了解，新冠肺炎患者的发病都会经历一个从感染后无症状，到轻度症状出现，再到严重症状出现的过程。

不同病程、不同病情患者机体中的病毒存在量可能不同，已有病毒感染，但由于在相关部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以致于现有方法检测不到，也称窗口期。

王成彬表示，对临床高度疑似新冠肺炎患者，应该连续采集标本进行检测，这可能是临床患者多次检测阴性，阳性结果出现晚的主要原因之一。

其实任何病原学检测，都不能只根据一次阴性结果而做出排除性诊断，更不能根据核酸检测阴性而漏诊临床高度疑似的新冠肺炎患者，尤其在高发地区，在大面积流行期间。

此外，患者不同部位的病毒存量也不一样。

机体被病毒感染后，病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部，再到气管和支气管，进而到达肺泡，不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同，由这些部位细胞所含病毒受体占比不同所致。

新型冠状病毒感染，肺泡上皮细胞的病毒受体表达占比*高，气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等则占比极低。

因此，下呼吸道的病毒量明显高于上呼吸道，呼吸道病毒检出可能性又高于血液。肺泡灌洗液中*容易检出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。

但是采集肺泡灌洗液的标本却没有那么简单。

标本：假阴性无法完全避免

根据王成彬表述，很多专家从实践工作中总结出的经验认为，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口鼻咽拭子采集的标本；鼻咽拭子标本检测阳性率又高于口咽拭子。

口鼻咽拭子这也是这两天被广泛评论的某患者咽拭子标本三次核酸检测阴性，收住院后在抢救过程中采集肺泡灌洗液标本核酸检测阳性的原因。

虽然肺泡灌洗液的阳性率*高，但是操作复杂，采集难度大，而且容易引起患者喷射，导致采集操作者感染风险大，因此难以作为常规采样方法，只有部分气管切开、上呼吸机抢救病人可用。

此外根据国家卫健委检验中心信息，新冠肺炎患者通常为干咳，下呼吸道的痰标本也较难得到。

由于操作的方便性和患者的接受程度，目前临床*常用的标本是口咽部拭子，其次是鼻咽部拭子。

因此，采集部位不当，如采集口咽拭子时，采集深度不够；采集鼻咽拭子没有采到鼻腔深处等，采集到的细胞可能大部分都不含病毒，即可能造成假阴性。

此外，如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，*后也会导致检测结果阴性。

对比国家卫健委发布的第四版、第五版和第六版诊疗方案可以发现，第五版已经将第四版的“咽拭子”改为“鼻咽拭子”。

第六版又添加内容强调：为提高核酸检测阳性率，建议尽可能留取痰液，实施气管插管患者采集下呼吸道分泌物，标本采集后尽快送检。

采集患者标本的重点已经越来越偏向下呼吸道，检验的阳性率或许也将明显提高。

实际上，在样本中寻找病毒，就像在一本百万字的书里寻找错别字，理论上说，即使只有一个错别字也可以被发现。

但实际上，由于成本和时间等的限制，只能从中随机抽取10万或者20万字进行查找，如果错别字数较少，就有可能不在被抽取的字数当中，因此无法找到。

同样，样本中病毒数量低于一定程度，试剂也就无法检出。因此从这个层面上看，病毒核酸检测的“假阴性”或许是无法完全避免的。

检测试剂：火速获批，质量或参差不齐

疫情面前，检测试剂获批十分迅速。

1月26日国家药监局发布消息表示，已应急审批通过4家企业4个新型冠状病毒检测产品，包括华大基因新型冠状病毒检测试剂盒、华大智造DNBSEQ-T7测序系统获批、上海捷诺rtpcr、上海之江rtpcr。

据了解，国家药监局启动应急审批程序，仅4天就批准四家公司四个产品，紧急应对疫情。目前已有多家械企完成新冠病毒检测试剂的研发或者获得注册证。

根据上市公司公告，达安基因已获得新型冠状病毒（2019-nCoV)核酸检测试剂盒（荧光 PCR法）的医疗器械注册证。

迪安诊断、万孚生物、美康生物、透景生命等械企都已完成新型冠状病毒（2019-nCoV）系列检测试剂新品的研发，部分已进入应急审批通道。

据不完全统计，目前有超过130家企业在生产新型冠状病毒相关检测试剂。

对于这些检测试剂的质量，近日重庆市人民医院三院院区检验科发布《6 种国产新型冠状病毒核酸检测试剂检测性能比较与分析》（下称《比较与分析》）。

上述检验科医务人员收集院内1 例弱阳性患者不同时间点采集的咽拭子标本。因为弱阳性样品往往对试剂盒的灵敏度有较高要求，如果*低检出限达不到样品的检测浓度，则会导致假阴性结果。

根据《比较与分析》，试验具体选取了圣湘生物、北京卡尤迪、硕世生物、中元生物、中山达安和北京卓成惠生的新冠病毒核酸检测试剂盒，基因检测类型均为 ORF1ab 和 N 基因两个靶点。

*终研究结果表明，国产 6 种试剂对弱阳性样品的检测能力参差不齐，少数试剂对两个基因靶点均能检出，而部分试剂只能检测出其中一个。

从试剂方面分析原因，可能与试剂引物设计有关，也可能与各位点检测灵敏度相关。

某知名诊断械企相关负责人对赛柏蓝器械表示，检测试剂灵敏度是个重要因素，因为DNA比RNA稳定，所以要先把RNA逆转录成DNA，到一定浓度后，通过试剂中的引物和探针对相应基因靶点进行检测。

每个厂家试剂中引物和探针的灵敏度都有区别，浓度、纯化程度以及试剂中酶、金属离子等成分与质量的差异，都可能影响扩增效率和*后检测结果的灵敏度。

王成彬分析称，由于本次疫情的特殊和紧迫性，很多厂家研发试剂来不及完成正常流程，无法得到一定数量临床患者标本的验证，只能通过模拟真实标本中的病毒进行验证。

国家卫健委临床检验中心也表示，部分厂家的试剂产品由于研发时间短，也没有使用已知临床样本进行必要的性能确认，可能存在对试剂优化不充分以及试剂批间差异大等问题。

实验室：30家机构，符合率100%

除了检测试剂本身，实验室规范与否也会对检测结果产生重要影响。标本运输保存条件、临床实验室的规范操作、结果判读和质量控制等都是保证检测结果准确可靠的关键因素。

那么我国实验室的检测能力如何？

近日根据中华医学会检验医学分会消息，贵州省临床检验中心组织了针对省内34家新型冠状病毒核酸检测实验室进行技术考核，考核品一共分10个批次，包括阴性、弱阳性和阳性。

*终结果显示，考核发放样品34家，至规定时间回收结果30份。在30家检测机构，总符合率为100%。

其中阳性样品符合率、阴性样品符合率、全省疾控系统总符合率、全省医疗机构总符合率、第三方机构总符合率均为100%。本次考核，一共涉及6个厂家试剂，其符合率也为100%。

贵州省临床试验中心表示，在回报的30家检测实验室中，用于考核样品检测的一共为6家产品，并且主要集中在传统的2家基因试剂厂家上，占87%左右。

贵州省临床试验中心认为，对于社会关注的核酸检测阳性率低的问题，主要是由病人疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输等问题引起。加强与临床和疾控采样人员的沟通和联系，共同对分析前质量进行管理，以保障检验质量，其意义非常重要。

据了解，2月21日国家卫健委印发的《新型冠状病毒肺炎防控方案（第五版）》，同时发布的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》对标本采集、处理、包装、保存、送检、检测以及等实验室检测技术提出详细要求。

例如采集咽拭子时，要求被采集人员头部微仰，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，将拭子越过舌根，在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次进行采集。

以此规范标本采集等流程操作，尽量避免影响检验结果。

抗体检测辅助，降低假阴性率

综上所述，核酸检验的假阴性有多方面因素，如标本中寻找病毒有概率性、不可能所有医护人员都操作规范等，类似这样的问题一时难以解决，但并不代表没有其他办法有效降低假阴性的概率。

2月15日据央视新闻报道，在钟南山院士的指导下，实验室联合多家研究机构，*新研发出新型冠状病毒IgM抗体快速检测试剂盒，并已在实验室和临床完成初步评价。

据介绍，此试剂盒仅需采取一滴血就可在15分钟内肉眼观察获得检测结果，且患者的血浆稀释500至1000倍后，仍能检测出阳性条带。

国家卫健委临床检验中心表示，补充新型冠状病毒特异抗体检测，这一办法对降低假阴性率行之有效。

据国家药监局器审中心官微介绍，特异性抗体检测是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过抗原检测抗体的存在，间接证明人体已感染或曾感染新型冠状病毒。

据了解，检测的抗体主要分为IgM和IgG两类。一般IgM抗体在感染早期出现，IgG抗体在感染中晚期出现，滴度有一个持续增高的过程，并在血液循环中保持较长时间存在。

但是要注意，虽然抗体检测能在一定程度上证明人体感染病毒，但并不能取代核酸检验的金标准地位。

国家卫健委临床检验中心强调，检测特异抗体也可以明确患者是否“近期或既往感染过新型冠状病毒”，有助于核酸检测阴性但临床上疑似患者的确诊。

但是特异抗体检测阳性不能像病毒核酸检测阳性一样作为病毒感染的“金标准”，因为抗体检测容易受到血液标本中的一些干扰物质，如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等的存在而出现“假阳性”结果。

与此同时，已有械企完成研发或取得相关产品的注册证。

2月21日，安图生物发布公告称，近日已取得抗体检测试剂盒的《医疗器械注册证》，具体包括肺炎支原体 IgG 抗体检测试剂盒、呼吸道合胞病毒IgM 抗体检测试剂盒、肠 道 病毒 71 型IgM 抗体检测试剂盒。

2月20日，万孚生物发布公告称，公司收到国务院通知，申报的适宜于疫情现场的新型冠状病毒抗原快速检测试剂、基于荧光微球/胶体金免疫层析技术新型冠状病毒抗体快速检测试剂，二个项目的产品推荐进入应急审批通道。

2月21日，迈克生物发布公告称，目前公司已完成新型冠状病毒 IgG 和 IgM 抗体检测试剂盒（直接化学发光法）、新型冠状病毒（SARS-Cov-2）IgG/IgM 抗体检测试剂盒（胶体金法）的研发工作。